参考文献：Zheng L, Zou Y, Xie T, et al. Discovery of a Dual Tubulin and Neuropilin-1 (NRP1) Inhibitor with Potent In Vivo Anti-Tumor Activity via Pharmacophore-based Docking Screening, Structure Optimization, and Biological Evaluation. J Med Chem. 2023 Dec 14;66(23):16187-16200. doi: 10.1021/acs.jmedchem.3c01572. （IF= 8.039）
设计思路：
（1）、微管蛋白抑制剂为广谱抑制剂，细胞毒性强；（2）、神经纤毛蛋白-1 (NRP1)抑制剂能够抑制血管生成；（3）、同时抑制NRP1能够解决微管蛋白抑制剂无法抑制肿瘤转移的问题。
主要结果：
双靶向微管蛋白/NRP1抑制剂的虚拟筛选
为了获得新型双靶向微管蛋白/NRP1抑制剂的所有三维化学和结构信息，下载了微管蛋白与配体共结晶的高分辨率结和NRP1与配体共结晶的高分辨率结，分别构建了微管蛋白和NRP1的药效团模型。如图1A和图1B所示，这两种药效团模型代表了与微管蛋白和NRP1活性位点残基的重要相互作用。
多步骤筛选方案的工作流程如图1C所示。总共有267,919种化合物预处理后进行基于药效团的对接筛选。计算每个化合物的对接得分，以预测其与目标的结合亲和力。最后基于对接结果， TNs 1 - 14通过了PAINS筛选，并进行了进一步的生物学评价。
TNs 1−14的微管蛋白聚合和NRP1抑制活性
我们首先检测了14种化合物在12 μM浓度下对微管蛋白聚合和NRP1的抑制活性。以CA-4和EG00229为阳性对照。如表1所示，具有精氨酸结构的化合物(TN-2、TN-12和TN-13)如EG00229对NRP1的抑制作用 ≥ 75 %。此外，与TN-2、TN-12和TN-13相比，TN-14的精氨酸结构修饰导致其NRP1抑制活性相对降低，这可能与NRP1口袋狭窄造成的空间位阻有关。有趣的是，尽管TN-9没有精氨酸结构，但它仍然对NRP1有抑制作用。此外，可能是由于图1A所示的微管蛋白的大疏水性口袋，只有含有疏水性基团3,4,5-三甲氧基苯基的化合物(TNs 1−11)对微管蛋白聚合有抑制作用。14个化合物中，只有TN-2同时具有3,4,5-三甲氧基苯基和精氨酸，具有最佳的微管蛋白聚合率(96 ± 4 %)和NRP1抑制率(94 ± 3 %)，优于阳性对照CA-4(94±5%)和EG00229(87±6%)。因此，选择TN-2作为进一步结构优化的起点，研究新型双微管蛋白/NRP1抑制剂。
TN-2与微管蛋白和NRP1的结合模式
在TN-2结构优化之前，通过分子对接探索TN-2与微管蛋白和NRP1的可能结合模式。图2A显示，TN-2可以结合到微管蛋白的疏水口袋上，并与以下氨基酸发生良好的疏水相互作用:Ile318、Leu248、Ala250、Leu255、Met259和Ile378。此外，TN-2与Pro348和Val257形成了额外的氢键，这可能极大地促进了TN-2在微管蛋白活性位点的稳定。NRP1活性位点的对接模型显示，TN-2与狭长的结合口袋匹配良好，与Tyr81和Asp48表现出多重氢键相互作用(图2B)。同时，TN-2的芳香环与Tyr25发生疏水相互作用，这可能会增强TN-2的效力。总之，这些结果表明TN-2具有与微管蛋白和NRP1活性位点残基相互作用的潜力。
TN-2抑制微管聚合
为了探讨TN-2对微管聚合的抑制能力，我们进一步采用免疫荧光法测定了TN-2处理PC-3细胞中β-微管蛋白的分布。如图3所示，对照细胞网状结构清晰，细胞核形状正常，细胞核周围微管分布均匀，微管被β-微管蛋白抗体标记。然而，在TN-2处理的细胞中观察到一定程度的收缩，核破坏程度和微管分散程度呈剂量依赖性逐渐增加。值得注意的是，在2.5 μM和12.5 μM的TN-2处理下，正常的微管网络被破坏，细胞核模糊甚至消失。这些数据表明，TN2可以与微管蛋白结合，从而抑制微管蛋白聚合和破坏微管。
TN-2对PC-3细胞周期阻滞的影响
由于大多数CBSIs都表现出诱导G2/M阻滞的能力，因此我们进一步通过流式细胞术检测TN-2是否可以阻断PC-3细胞的G2/M转变。图6A、B的结果显示，TN-2处理逐渐增加了G2/M相的比例(对照，3.24%;0.1 μm, 4.48%;0.5 μm, 8.96%;2.5 μm, 11.58%;12.5 μM, 14.02%)。我们进一步研究了TN-2诱导的G2/ M期阻滞与细胞周期调节蛋白表达的关系。由于Cyclin B1和cdc2在调节细胞周期中起关键作用，我们在TN-2处理的PC-3细胞中检测了Cyclin B1和p-cdc2 (cdc2的失活形式)的表达水平。正如预期的那样，p-cdc2的表达随着TN-2的处理而逐渐增加，而Cyclin B1的表达则下降(图6C,D)。
TN-2对PC-3细胞凋亡的影响
流式细胞术检测TN-2处理和未处理PC-3细胞的细胞凋亡情况。如图7A所示，TN-2可显著提高PC3细胞的凋亡率。此外，我们检测到了cleaved PARP和cleaved caspase-3(两种重要的凋亡调节蛋白)的表达，发现在TN-2处理的PC-3细胞中，这两种蛋白的表达显著增加(图7B,C)。这些数据表明，TN-2可以通过激活PARP/caspase-3通路有效诱导PC-3细胞凋亡。
TN-2对HUVECs小管形成及转移能力的影响
我们采用HUVECs作为模型来研究TN-2的血管生成特性。结果显示，与对照组相比，TN-2以剂量依赖的方式显著干扰了试管的形成(图8A,B)。令人欣慰的是，我们可以观察到，在12.5 μM的TN-2处理下，HUVECs非常分散，显示出由相互连接的细胞组成的可忽略不计的网络。这些结果表明，TN-2可以显著抑制血管生成。通过伤口愈合实验进一步评估TN-2对HUVEC迁移能力的影响。用不同浓度的TN-2处理HUVECs 24或48 h，如图9A−C所示，TN-2处理组伤口恢复率明显低于对照组。此外，为了探讨TN-2对HUVEC侵袭的影响，我们进行了transwell实验。结果显示，经TN-2处理后，从腔室上部到底部的浸润细胞数量明显减少(图10A,B)。综上所述，这些数据表明TN-2可以显著减弱HUVEC的迁移和侵袭。
TN-2在体内抑制肿瘤生长
体内实验结果表明TN-2具有很强的抗癌功效，而且没有可检测到的副作用。
结论：
在这项研究中，我们成功地采用了多步骤筛选方案，发现了一种新的双重靶向微管蛋/NRP1抑制剂TN-2；为解决微管蛋白抑制剂临床应用中出现的无法抑制肿瘤转移问题提供新思路；TN-2体内疗效显著且安全性佳，具有较好的应用前景。